中國農科院利用LUYOR-3415進行瓜類研究

作者：http://www.luyoruv.com 時間：2026-04-09 02:38:02瀏覽1236 次

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中國農業科學院蔬菜花卉研究所近日在《Horticulture Research》發表了文獻為《Targeted creation of new mutants with compact plant architecture using CRISPR/Cas9 genome editing by an optimized genetic transformation procedure in cucurbit plants》。本文獻中采用了LUYOR-3415RG熒光蛋白激發光源來篩選GFP陽性的植株。

文獻摘要

葫蘆科的水果和蔬菜，如黃瓜、甜瓜、西xi瓜gua和he南nan瓜gua，對dui人ren類lei飲yin食shi有you很hen大da貢gong獻xian。基ji因yin組zu編bian輯ji技ji術shu的de廣guang泛fan使shi用yong極ji大da地di加jia速su了le基ji因yin功gong能neng表biao征zheng和he作zuo物wu改gai良liang。然ran而er，大da多duo數shu經jing濟ji上shang重zhong要yao的de葫hu蘆lu科ke植zhi物wu，包bao括kuo甜tian瓜gua和he南nan瓜gua，仍reng然ran對dui標biao準zhun的de根gen癌ai農nong杆gan菌jun介jie導dao的de轉zhuan化hua具ju有you抗kang拒ju性xing，從cong而er限xian製zhi了le基ji因yin組zu編bian輯ji技ji術shu的de有you效xiao使shi用yong。在zai本ben研yan究jiu中zhong，我wo們men采cai用yong“佳滲透強度”策略建立了高效的甜瓜和南瓜遺傳轉化係統。我們利用這種方法的力量來靶向ERECTA的同源物受體激酶基因家族，並創造了等位基因，導致甜瓜、南瓜和黃瓜中節間較短的緊湊植物結構。此處介紹的優化轉化方法能夠實現穩定的 CRISPR/Cas9 介導的誘變，並為葫蘆科作物的功能基因操作提供了堅實的基礎。

葫(hu)蘆(lu)科(ke)長(chang)期(qi)以(yi)來(lai)被(bei)認(ren)為(wei)是(shi)難(nan)轉(zhuan)化(hua)的(de)作(zuo)物(wu)之(zhi)一(yi)，嚴(yan)重(zhong)阻(zu)礙(ai)了(le)基(ji)因(yin)組(zu)編(bian)輯(ji)工(gong)具(ju)的(de)應(ying)用(yong)。在(zai)黃(huang)瓜(gua)和(he)西(xi)瓜(gua)中(zhong)已(yi)經(jing)報(bao)道(dao)了(le)成(cheng)功(gong)的(de)遺(yi)傳(chuan)轉(zhuan)化(hua)和(he)基(ji)因(yin)組(zu)編(bian)輯(ji)[ 13 , 14 ]。raner，huangguadezhuanhuaxiaolvrengranhendi，yongyuxiguazaishengdejianjieqiguanfashengmuqianyuqitahulukezuowubujianrong。yinci，qitajingjishangzhongyaodehulukezuowu，rutianguahenangua，rengrannanyiwendingzhuanhua，zhejidadizuailegongnengjiyinzuyanjiuhekuaisuchanshengfuyuzhexiezuowulixiangxingzhuangdetubian。

農杆菌浸潤被認為是建立高效穩定的遺傳轉化係統的關鍵。在器官發生過程中，不定芽從不同植物物種的原形成層或形成層細胞開始 [ 25 ]，這(zhe)些(xie)組(zu)成(cheng)了(le)農(nong)杆(gan)菌(jun)感(gan)染(ran)的(de)靶(ba)組(zu)織(zhi)。然(ran)而(er)，盡(jin)管(guan)以(yi)前(qian)的(de)研(yan)究(jiu)認(ren)識(shi)到(dao)需(xu)要(yao)感(gan)染(ran)外(wai)植(zhi)體(ti)的(de)更(geng)深(shen)細(xi)胞(bao)層(ceng)，但(dan)尚(shang)未(wei)開(kai)發(fa)出(chu)統(tong)一(yi)的(de)標(biao)準(zhun)協(xie)議(yi)來(lai)實(shi)現(xian)這(zhe)一(yi)目(mu)標(biao)。在(zai)實(shi)踐(jian)中(zhong)，必(bi)須(xu)在(zai)感(gan)受(shou)態(tai)細(xi)胞(bao)的(de)充(chong)分(fen)感(gan)染(ran)和(he)整(zheng)個(ge)外(wai)植(zhi)體(ti)的(de)過(guo)度(du)感(gan)染(ran)之(zhi)間(jian)取(qu)得(de)良(liang)好(hao)的(de)平(ping)衡(heng)，這(zhe)會(hui)導(dao)致(zhi)嚴(yan)重(zhong)的(de)損(sun)傷(shang)並(bing)降(jiang)低(di)轉(zhuan)化(hua)效(xiao)率(lv)。

weilekefuzhexiewenti，womencaiyonglejiaqiangdudejinruncelvelaiquedingtedingdeyizutiaojian，yiquebaoxueguanzuzhizhongdexingchengcengxibaowanquanganran，tongshiduiwaizhitizaochengjinkenengxiaodesunshang。zaizheli，womenquedinglezhenkongshentou、超聲處理和微刷的佳強度，以獲得良好的甜瓜和南瓜轉化效率，我們還在培養基中添加了抗氧化劑 LA，以保護外植體免受損傷。在這些優化的條件下，維管組織感染有效，外植體損傷小，導致甜瓜和南瓜的穩定遺傳轉化，效率約為4%。使用相同的策略，我們提高了不同黃瓜種質的轉化效率，並部分克服了基因型依賴性。

這種在葫蘆科作物中高效且穩定的遺傳轉化係統使我們能夠在這些物種中進行 CRISPR/Cas9 介導的基因組編輯。擬南芥ER基因家族編碼富含亮氨酸的重複受體樣激酶，已被證明可調節莖伸長 [ 27 ]。編輯瓜類ER同源物在甜瓜、南瓜和黃瓜中產生了er突變體。突變體都具有較短的節間和矮化表型，這可能有利於改善植物結構和育種。

總之，我們提出了一種高效穩定的甜瓜和南瓜遺傳轉化係統，並證明 CRISPR/Cas9 介jie導dao的de基ji因yin組zu編bian輯ji在zai這zhe些xie葫hu蘆lu科ke作zuo物wu中zhong是shi有you效xiao的de。這zhe裏li描miao述shu的de方fang法fa將jiang大da大da加jia快kuai對dui葫hu蘆lu科ke作zuo物wu的de研yan究jiu，包bao括kuo基ji礎chu植zhi物wu生sheng物wu學xue和he優you良liang品pin係xi的de創chuang造zao。

植物材料和生長條件

本研究分析了十個甜瓜品種：P147（栽培甜瓜）、ivf105（栽培甜瓜）、m1（栽培甜瓜）、m2（栽培甜瓜）、m3（栽培甜瓜）、m4（栽培甜瓜）、m5（野生甜瓜） , m6 (栽培甜瓜), m7 (栽培葡萄) 和景玉（商業雜交種），其中 ivf105 和 m1 到 m7 由中國農業科學院蔬菜花卉研究所（IVF）王懷鬆提供。本研究使用黃瓜自交係Cu2（華南型）、新太米刺（華北型）、404（華北型）和Eu1（歐洲型）的種子。兩種商業moschata材料，金心針4號和金心針11hao，yongyunanguagaizao。zaifenhuaheshenggenjieduanjiangzuzhipeiyangwubaochizaipeiyangshizhong。shenggenhou，jiangzaishengzhiwuzhuanyidaopeiyangxiangzhongyueyizhou，ranhouzaiwenshizhongzhongzhi，guangzhaotiaojianwei 16 小時光照/8 小時黑暗，溫度範圍為 18°C 至 24°C。

需要使種子發芽以獲得外植體，種子發芽的條件如下。將種子在 50°C 的溫蒸餾水中浸泡 30 分鍾，然後用鑷子去除種皮。種子用 75% 乙醇 15 秒和 1% 次氯酸鈉溶液 15 分鍾進行表麵，然後用無菌蒸餾水衝洗 6 次。瓜子、南瓜和黃瓜的滅菌種子在 28°C 下在含有 7.5 mL 滅菌水的培養皿上塗抹 1-2 天。在 28°C 下，僅將 Cu2 種子散布在含有 GM 培養基的培養皿上。

sgRNA設計和質粒構建

sgRNA 是使用 CRISPR-GE 網絡工具 ( http://skl.scau.edu.cn ) 設計的。如前所述 [ 49 ] 將 sgRNA 插入 pBSE402 載體。簡而言之，將含有 1.5 μL 100 μM 正向引物、1.5 μL 100 μM 反向引物、5 μL 10× NEB 緩衝液 3.1 和 42 μL 水的 50 μL 混合物在 95°C 下孵育 5 分鍾，然後升溫以 0.1°C/s 下降到 20°C，產生一個短的雙鏈 DNA 片段。使用限製酶Bsa I 和 T4 連接酶 (New England Biolabs)將短 DNA 片段插入 pBSE402 。將構建的重組載體轉化農杆菌菌株EHA105。引物顯示在表 S2。

檢測 GFP 熒光

為了篩選 GFP 陽性植物，在組織培養階段使用 Leica MZ10 F 立體顯微鏡（Leica Microsystems，Germany）檢查再生一個月的外植體。在溫室中用LUYOR-3415RG激發光源（Luyor Instrument，上海）激發後觀察植物的綠色熒光蛋白GFP熒光。將不同感染強度處理的外植體在冰上沿橫向和縱向手工切片，在立體顯微鏡下立即觀察到有血管組織部分的GFP熒光。

QQ圖片20220505205847.jpg

上圖為：（a，b和c）GFP強度，感染維管組織的外植體，以及五種不同處理下甜瓜m1的存活率，分別。數據是三個重複的平均值，誤差線表示標準偏差。不同的小寫字母表示差異顯著（p<0.05，Tukey 檢驗）。 (d) 將再生的轉基因 T0 甜瓜植物轉移到土壤中。轉基因甜瓜 T0 植物的 GFP 熒光頂端分生組織 (e) 和種子 (f 和 g)。 LUYOR-3415RG 的 GFP 通道下甜瓜的轉基因 T1 植物 (h) 和 WT (i)。組織因 GFP 表達而呈綠色，因葉綠素自發熒光而呈紅色。