近紅外熒光蛋白是綠色熒光蛋白同源的一類熒光蛋白，可利用自身特殊的結構催化形成生色團，且具備許多優良的特點：
(1)易yi於yu檢jian測ce，靈ling敏min度du高gao，熒ying光guang性xing質zhi穩wen定ding。熒ying光guang蛋dan白bai生sheng色se團tuan的de成cheng熟shu不bu需xu要yao添tian加jia底di物wu或huo其qi他ta輔fu助zhu因yin子zi，僅jin在zai激ji發fa光guang激ji發fa下xia就jiu能neng發fa出chu熒ying光guang，單dan細xi胞bao標biao記ji清qing晰xi，熒光顯微鏡下很容易觀察到；
(2)熒光蛋白基因編碼序列短，易構建載體；
(3)細胞毒性小，可直接標記活細胞或活體組織；
(4)相比於 GFP，它的激發光和發射光波長更長，位於近紅光區(650~900 nm)，在動物組織中光吸收和光散射較低，有較高的穿透性[22]，更適宜於動物活體組織的深層成像，是活體成像更為理想的熒光標記分子。
本研究使用的近紅外熒光蛋白 iRFP682 的激發光和發射光波長分別為 663 nm 和 682 nm，是單體熒光蛋白分子，其發光性質較為穩定，較長的光譜特點使其在活體動物組織成像的應用中更具潛力。
熒(ying)光(guang)蛋(dan)白(bai)作(zuo)為(wei)標(biao)記(ji)分(fen)子(zi)在(zai)生(sheng)命(ming)科(ke)學(xue)的(de)發(fa)展(zhan)中(zhong)發(fa)揮(hui)了(le)重(zhong)要(yao)作(zuo)用(yong)。熒(ying)光(guang)蛋(dan)白(bai)具(ju)備(bei)良(liang)好(hao)的(de)性(xing)能(neng)，其(qi)在(zai)發(fa)揮(hui)標(biao)記(ji)分(fen)子(zi)的(de)作(zuo)用(yong)中(zhong)相(xiang)比(bi)於(yu)傳(chuan)統(tong)的(de)生(sheng)物(wu)標(biao)記(ji)分(fen)子(zi)有(you)諸(zhu)多(duo)優(you)良(liang)特(te)點(dian)，不(bu)需(xu)要(yao)額(e)外(wai)的(de)底(di)物(wu)或(huo)輔(fu)助(zhu)因(yin)子(zi)，僅(jin)在(zai)藍(lan)光(guang)或(huo)紫(zi)外(wai)激(ji)發(fa)下(xia)即(ji)可(ke)發(fa)出(chu)明(ming)亮(liang)的(de)熒(ying)光(guang)，檢(jian)測(ce)方(fang)便(bian)且(qie)靈(ling)敏(min)性(xing)高(gao)。熒(ying)光(guang)蛋(dan)白(bai)獨(du)特(te)的(de)發(fa)光(guang)特(te)性(xing)使(shi)其(qi)廣(guang)泛(fan)應(ying)用(yong)於(yu)動(dong)物(wu)、植物、微生物等的研究中，涉及分子水平、細胞水平，再到動物活體或全身成像等。
近紅外熒光蛋白（Near-infrared fluorescent protein，iRFP）是綠色熒光蛋白同源的一類熒光蛋白，具備綠色熒光蛋白的發光優點。但是，相比於GFP，它的激發光和發射光波長更長，位於近紅光區（650~900nm），在動物組織中光吸收和光散射較低，有較高的穿透性，更適宜於動物活體組織的深層成像，是深層成像更為理想的熒光標記分子。
本文使用的iRFP713的激發光和發射光波長分別為690nm和713nm，是單體熒光蛋白分子，其發光性質較為穩定，較長的光譜特點使其在活體動物組織成像的應用中更具潛力。 腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）是一種線性的單鏈DNA的微小病毒，分子量小，是當前zui受歡迎的基因載體之一。AAV的基因組中有三個重要的結構：ITR序列，Rep和Cap基因，ITR是AAV DNA兩端的倒置末端重複序列，是腺相關病毒載體不可或缺的順式作用元件。ITR自我互補形成倒T型(xing)結(jie)構(gou)，能(neng)維(wei)持(chi)基(ji)因(yin)組(zu)穩(wen)定(ding)，使(shi)外(wai)源(yuan)基(ji)因(yin)能(neng)夠(gou)在(zai)細(xi)胞(bao)及(ji)動(dong)物(wu)許(xu)多(duo)組(zu)織(zhi)中(zhong)長(chang)期(qi)穩(wen)定(ding)有(you)效(xiao)地(di)表(biao)達(da)。腺(xian)相(xiang)關(guan)病(bing)毒(du)無(wu)病(bing)原(yuan)性(xing)，一(yi)般(ban)不(bu)會(hui)致(zhi)病(bing)，不(bu)會(hui)產(chan)生(sheng)細(xi)胞(bao)內(nei)免(mian)疫(yi)反(fan)應(ying)和(he)細(xi)胞(bao)毒(du)性(xing)，對(dui)生(sheng)物(wu)機(ji)體(ti)安(an)全(quan)，是(shi)較(jiao)為(wei)安(an)全(quan)的(de)病(bing)毒(du)載(zai)體(ti)。 本論文通過分子克隆等手段將iRFP713基因克隆到含AAV2的ITR序列的質粒載體上構建重組真核表達載體pAAV-iRFP713。pAAV-iRFP713質粒和pDG質粒共轉染AAV-293細胞後，利用pAAV-iRFP713質粒提供AAV2病毒所必須的ITR序列，輔助質粒pDG提供AAV2重組複製、包裝病毒外殼等所必須的Rep和Cap基因，在宿主細胞內包裝攜帶iRFP713基因的重組腺相關病毒(Recombinant adeno-associated virus, rAAV ) rAAV-iRFP713。72h後收集重組病毒並分離濃縮純化，經實時熒光定量PCR測定其拷貝數即物理滴度。 xiedaijinhongwaiyingguangdanbaijiyindezhongzubiaodazhilizaitihezhongzubingduzaititiwaizhuanranxibaohou，zaiduozhongxibaozhongjunnengchenggongbiaoda，xibaobiaojixiaoguolianghao。weilejianyaniRFP713在動物組織中的表達和成像效果，將重組病毒注射小鼠骨骼肌，在兩天，一周、兩周、一個月時在近紅外熒光活體成像係統觀察到熒光信號，表明腺相關病毒載體能攜帶近紅外熒光蛋白長期穩定表達。 綜合上述，iRFP713基因表達穩定，熒光信號強，是良好的細胞標記分子。重組腺相關病毒攜帶iRFP713在小鼠骨骼肌中能長久有效穩定的表達。此外，利用腺相關病毒的定點整合特性，我們將建立一株穩定表達iRFP713的乳腺癌細胞株。隨著研究的進一步進行，iRFP將在動物腫瘤模型等活體動物組織成像的研究應用中表現更為優越。
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