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熒光顯微鏡的原理是什麼?
與普通光學顯微鏡不同，熒光顯微鏡不是通過普通光源的照射來觀察標本，而是利用一定波長的光（通常是紫外光、藍紫光）zaixianweijingxiajifabiaobenzhongdeyingguangwuzhifachuyingguang，suoyi，yingguangxianweijingguangyuandezuoyongbushizhijiezhaoshe，ershizuoweinengliangyuanjifabiaobenneibudeyingguangwuzhi。womenzhisuoyinengguanchadaobiaoben，shiyouyuguangyuandezhaoshe，ershibiaobenzhongdeyingguangwuzhixishoujifaguangnenghouchengxiandeyingguangxianxiang。
youcikejian，yingguangxianweijingdezhuyaotedianshitadeguangyuankeyizaitedingbochangfanweineitigongdaliangdejifaguang，shibeiceyangpinzhongdeyingguangwuzhinenggouhuodebeicewudejifaguang。biyaodeqiangdu。tongshi，yingguangxianweijingbixuyouxiangyingdelvguangxitong。
熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學的重要工具。它由超高壓光源、濾光係統（包括激發和加壓濾板）、光學係統和照相係統等主要部件組成。它利用一定波長的光激發標本發射熒光。
激發熒光的方式：根據光的波長範圍分為UV激發法（使用紫外照射法）和BV激發法（使用藍紫光）。紫外激發法使用短於 400 nm 的(de)近(jin)紫(zi)外(wai)光(guang)進(jin)行(xing)激(ji)發(fa)。該(gai)方(fang)法(fa)沒(mei)有(you)可(ke)見(jian)的(de)激(ji)發(fa)光(guang)，因(yin)此(ci)觀(guan)察(cha)到(dao)的(de)熒(ying)光(guang)表(biao)現(xian)出(chu)染(ran)料(liao)的(de)固(gu)有(you)熒(ying)光(guang)，很(hen)容(rong)易(yi)區(qu)分(fen)標(biao)本(ben)上(shang)的(de)特(te)異(yi)性(xing)熒(ying)光(guang)和(he)背(bei)景(jing)組(zu)織(zhi)的(de)自(zi)發(fa)熒(ying)光(guang)。
BV激發法是從紫外光激發到以404nm和434nmweizhongxindelanguang。zhezhongfangfashiyonglanguangzhaoshebiaoben，yinciyingguangguanchaxitongdejiezhilvguangpianbixushiyongnenggouwanquanzudanglanguangbingwanquantongguosuoxudelvsehehuangseyingguangdelvguangpian。yongyuyingguangkangticedingdeyingguangranliao。jifaguangde*大吸收波長與熒光的*大發射波長比較接近，所以BVjifafazhongshiyongdelvguangpianbixushiyongruijiezhilvguangpian。gaifangfakeyishiyonglanguangzuoweijifaguang，yinciyingguangranliaodexishouxiaolvgao，keyihuodegengliangdetuxiang。quedianshi500nm以下看不到熒光，500nm以上會使整個圖像呈現黃色。在熒光抗體法中，大部分熒光染料都是獨特的。因此，在討論細微特異性時，上述 BV 激發方法的缺點往往影響很大。
綜上所述，熒光顯微鏡的照明根據聚光鏡的結構和激發光的波長可以分為以下三點。
1.從熒光圖像的對比度要求來看，紫外激發的暗場聚光鏡*適合照明。
2.考慮到圖像的亮度，BV激發濾光片的暗場觀察效率*高。
3.UV激發濾光片暗場觀察和BV激發暗場聚光鏡照明的特點可以說是介於這兩種照明方式之間，但前者的濾光片暗場特性更強，顯示的圖像更亮，對比度小；後者保留了暗場光路的特性，因此顯示圖像更暗，對比度提高。實際使用熒光顯微鏡時，應使用*適合標本要求的照明方法進行觀察。
必須指出的是，即使是用對比度*好hao的de紫zi外wai激ji發fa暗an場chang聚ju光guang器qi照zhao射she時shi，被bei試shi樣yang折zhe射she或huo散san射she的de部bu分fen紫zi外wai激ji發fa光guang也ye會hui進jin入ru物wu鏡jing，使shi加jia膠jiao麵mian和he光guang學xue玻bo璃li中zhong的de加jia膠jiao麵mian光guang學xue係xi統tong會hui受shou到dao激ji發fa的de影ying響xiang，產chan生sheng的de自zi發fa熒ying光guang會hui使shi圖tu像xiang的de響xiang應ying變bian差cha。因yin此ci，必bi須xu在zai目mu鏡jing前qian使shi用yong吸xi收shou紫zi外wai線xian的de濾lv光guang片pian作zuo為wei截jie止zhi濾lv光guang片pian。
熒光顯微鏡的基本操作步驟
1.安裝紫外線防護罩。
2.打開高壓汞燈電源控製箱開關。本文來自檢驗條網
3.插入遮光罩以中斷光路。
4.預熱5-10分鍾。
5.將載有樣品的載玻片放在載物台上。
6.選擇物鏡（按先低倍，後高倍的順序）。
7.轉動分光鏡組件轉盤，選擇需要的分光鏡組件：“O”為觀察透射光； “WU”用於觀察藍色熒光（如DAP1）； “WB”用於觀察綠色熒光（如FITC）； “WG”用於觀察紅色熒光（如TRITC）。
8.使用阻塞濾光片（目前大多數阻塞濾光片都內置在熒光顯微鏡中）。
9.通過粗細螺旋調節焦距。
10.打開連接顯微鏡的電腦，點擊數字成像係統軟件，采集數字圖像。
熒光顯微鏡的注意事項
1.由於熒光觀察所用的光源是高壓汞燈，發出的光中含有紫外線，對人眼有害，所以必須加裝紫外線防護罩。本文來自巡檢區網
2.為延長水銀燈的使用壽命，水銀燈打開後不能立即關閉，以免水銀蒸發不完全而損壞電極，一般需要15分鍾才能關閉。
3.shuiyindengximiehou，daiwanquanlengquehouzaizhongxinqidong。fouze，dengneideshuiyinzhengqihaimeiyouhuifudaoyetai，neizujixiao。ruguozaicishijiadianya，huizaochengduanlu，daozhigongdengbaozha。zhebujinhuisunhuaidianqi，gengzhongyaodeshi，gongzhengqihuiyichu，congerdaozhigongzuoshishoudaowuran。yinci，guanbishuiyindenghou，bunenglijizaicikaiqi，bixuzhishaodengdai 30 分鍾。
4.高壓水銀燈工作時放出大量熱量。因此工作環境溫度不宜過高，必須有良好的散熱條件。
5.汞燈的使用壽命約為200-300小時。電源控製箱上有一個時間累積計數器。用戶需要記錄累計小時數，當達到300小時時，需要更換新燈泡，否則亮度不夠，影響觀察。
熒光顯微鏡標本製作特點及觀察要求
1.幻燈片：幻燈片的厚度應該是0.在 8mm 到 1.2mm 之間，載玻片太厚，無法吸收更多的光，激發光難以聚集在標本上。載玻片必須光滑、厚度均勻且沒有明顯的自發熒光。有時使用石英玻璃載玻片。
2.蓋板玻璃：蓋板玻璃的厚度應在0.17mm左右，光滑、幹淨。為了增強激發光，也可以使用幹涉蓋玻片。這種特殊的蓋板玻璃表麵鍍有幾層物質（如氟化鎂），對不同波長的光有不同的幹涉作用，可以使熒光順利通過和反射。激發光，這種反射的激發光激發樣品中的熒光。
3.標本：組織切片或其他標本不宜太厚，一般5-20pm。太(tai)厚(hou)的(de)切(qie)片(pian)會(hui)導(dao)致(zhi)大(da)部(bu)分(fen)激(ji)發(fa)光(guang)在(zai)試(shi)樣(yang)下(xia)部(bu)被(bei)消(xiao)耗(hao)，而(er)物(wu)鏡(jing)直(zhi)接(jie)觀(guan)察(cha)到(dao)的(de)試(shi)樣(yang)上(shang)部(bu)不(bu)能(neng)被(bei)激(ji)發(fa)。切(qie)片(pian)折(zhe)疊(die)或(huo)雜(za)質(zhi)過(guo)多(duo)會(hui)影(ying)響(xiang)熒(ying)光(guang)觀(guan)察(cha)。
4.封固劑：封固劑必須無自發熒光，五色透明。添加防淬火劑後，用指甲油（實際使用中，指甲油密封效果很好，可以薄而均勻）將蓋板玻璃密封在其周圍，這樣不僅可以防止蓋板玻璃滑動，還能防止抗衰老。猝滅劑蒸發。在沒有抗淬滅劑的情況下，也可以使用含30%甘油的PBS，或等量的甘油和0.5mol/L碳酸鹽緩衝液（pH 9.0-9.5）的混合物封片。
5.鏡片的清潔：油性鏡片使用後，需要用無水乙醇或3：7酒精醚混合物擦拭鏡片紙。
6.及時觀察：染色後的標本要及時觀察，因為時間長了熒光會逐漸減弱。如果將標本存放在 4°C 的聚乙烯塑料袋中，可以延遲熒光衰減時間。
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