自 1992 nianlvseyingguangdanbaibeiyongyubiaojijiyin，gezhongyansedeyingguangdanbaibeikaifachu，muqianyoushangbaizhongdeyingguangdanbai。zaiwomendeshiyanzhong，jingchanghuiyongdaoyingguangdanbai，danshiruhexuanzeheshiyingguangdanbai，dedaowanmeideshiyanjieguo？xiangxinzhegewentiyizhikunraozhedajia，jianyuci，xiaobiancongbutongdejiaoduqukaolvruhexuanzeyingguangdanbai，xiwangkeyigeidajiazaixuanzeyingguangdanbaifangmiantigongyixiebangzhu。
dantixingzhijiangyingguangdanbaiyumubiaodanbaijinxingronghebiaoda，zhijiedizhuizongmubiaodanbaihuoshidingweimubiaodanbai，zhejiuyaoqiuyingguangdanbaishidanti，bunengyingxiangmubiaodanbaidegongnenghedingwei。yinci，womenjiangyingguangdanbaidedantixingzhifangzaiwei。
目前體外檢測熒光蛋白單體性質的方法有分子篩、沉(chen)降(jiang)平(ping)衡(heng)，可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)熒(ying)光(guang)蛋(dan)白(bai)分(fen)子(zi)篩(shai)的(de)峰(feng)圖(tu)是(shi)否(fou)狹(xia)窄(zhai)，單(dan)一(yi)粗(cu)略(lve)的(de)判(pan)斷(duan)其(qi)是(shi)否(fou)為(wei)單(dan)體(ti)，沉(chen)降(jiang)平(ping)衡(heng)能(neng)夠(gou)更(geng)加(jia)準(zhun)確(que)的(de)確(que)認(ren)其(qi)聚(ju)合(he)性(xing)質(zhi)。我(wo)們(men)使(shi)用(yong)熒(ying)光(guang)蛋(dan)白(bai)幾(ji)乎(hu)都(dou)是(shi)在(zai)細(xi)胞(bao)內(nei)或(huo)組(zu)織(zhi)內(nei)，因(yin)此(ci)我(wo)們(men)更(geng)加(jia)關(guan)心(xin)在(zai)生(sheng)理(li)條(tiao)件(jian)下(xia)，熒(ying)光(guang)蛋(dan)白(bai)的(de)聚(ju)合(he)性(xing)質(zhi)。
科學家巧妙地將熒光蛋白與細胞色素 P450 jinxingronghebiaoda，rangyingguangdanbaidingweizaineizhiwangdebaozhimian，yingguangdanbaidejuhexingzhihuishilinjindeyingguangdanbaijuhezaiyiqi，xingchengjujiti，zaijiguanggongjujiaoxianweijingxianenggoukandaoxibaohedezhouweiyouhendadedianzhuangjiegou。xiaobianyijingyongcizhongfangfajianceleduogeyingguangdanbai。
綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein，簡稱GFP）是在美國西北海岸所盛產的一種名為Aequorea victoria的水母中發現的一種可以發出綠色熒光的蛋白質。GFPzui早是在1962年由日本科學家下村修發現，是由238氨基酸組成的單體蛋白質，蛋白分子量約為27kD。GFP的晶體結構顯示，蛋白質中央是一個圓柱形水桶樣結構，長420nm，寬240nm，由11個圍繞中心α螺旋的反平行β折疊組成，桶的頂部由3個短的垂直片段覆蓋，底部由一個短的垂直片段覆蓋，對熒光活性很重要的生色團則位於桶的大空腔內。實驗表明GFP熒光產生的前提是桶狀結構完整性，去除N端6個氨基酸或C端9個氨基酸，GFP均會失去熒光。原因是GFP生色團的形成效率較低，而且形成過程受外界環境影響較大。
發光原理：
GFP的第65至67位的三個氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸）殘基，可自發地形成一種熒光發色團。當蛋白質鏈折疊時，這段被深埋在蛋白質內部的氨基酸片段，得以“親密接觸”，導致經環化形成咪唑酮，並發生脫水反應。在分子氧存在的條件下，發色團可進一步發生氧化脫氫，zui終成熟，形成可發射熒光的形式。具體過程為：在 O2存在下，GFP分子內第67位甘氨酸的酰胺對第65位絲氨酸的羧基進行親核攻擊，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應之後，導致芳香團與咪唑基結合，並zui終自發催化形成對羥基苯甲酸咪唑環酮生色。
GFP需要在氧化狀態下產生熒光，強還原劑能使GFP轉變為非熒光形式，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢複。一般來說弱還原劑並不會影響GFP熒光，中度氧化劑如生物材料的固定，脫水劑戊二酸或甲醛等對GFP熒光影響也不大。
發光特性：
GFP吸收的光譜zui大峰值為395nm（紫外），並有一個峰值為470nm的副吸收峰（藍光）；發射光譜zui大峰值為509nm（綠光），並帶有峰值為540nm的側峰（Shouder）。雖然450～490nm隻是GFP的副吸收峰，但由於該激發光對細胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。此外，GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）很相似，兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩定，在激發光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強，特別是在450～490nm藍光波長下更穩定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高，抗光漂白能力強，因此更適用於定量測定與分析。由於GFP熒光的產生不需要任何外源反應底物，因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。但因為GFP不是酶，熒光信號沒有酶學放大效果，因此GFP靈敏度可能低於某些酶類報告蛋白，比如螢火蟲熒光素酶等。
變體：
在GFP發現的半個世紀中，陸續衍生了多個變體，其中zui的要屬其紅移變體——增強型綠色熒光蛋白（enhanced GFP，EGFP；EGFP的zui大吸收峰位於488nm）。其他還包括發射熒光也發生改變的變體，包括藍色熒光蛋白：EBFP，EBFP2，Azurite，mKalama；青色熒光蛋白：ECFP，Cerulean，CyPet；黃色熒光蛋白：YFP，Citrine，Venus，YPet等等
小編發現綠色熒光蛋白中，單體性質比較好的是 mEmerald，該蛋白很少形成大的點狀結構，並且目前還沒有稱該蛋白會影響定位的報道。
此外 mEmerald 是一個非常穩定的綠色熒光蛋白，因此可以用於線性的結構光照明超分辨熒光顯微成像。
我們還發現紅色熒光蛋白中沒有一個單體性質特別好，相比較來說，mApple 的單體性質zui好，但是在使用該蛋白的過程中，發現 mAppple 會影響某些蛋白的定位，因此在使用紅色熒光蛋白時，要謹記紅色熒光蛋白可能會影響目標蛋白的定位。
PK 值每個熒光蛋白都有其zui合適的 pH 值，即在一定的 pH 值下，熒光強度zui高。有的熒光蛋白適合在酸性環境下使用，相反有的適合在堿性環境下使用，因此在選擇熒光蛋白時需要考慮熒光蛋白的 PK 值。
在細胞內，大多數細胞器內及細胞質的 pH 值都在 7.0 左右，然而溶酶體內的 pH 值就比較低，因此常規的熒光蛋白並不適合用於標記溶酶體內的蛋白。
mCherry 的 PK 值(zhi)比(bi)較(jiao)低(di)，適(shi)合(he)在(zai)酸(suan)性(xing)的(de)環(huan)境(jing)下(xia)使(shi)用(yong)，可(ke)以(yi)用(yong)於(yu)標(biao)記(ji)溶(rong)酶(mei)體(ti)內(nei)的(de)蛋(dan)白(bai)，但(dan)是(shi)該(gai)熒(ying)光(guang)蛋(dan)白(bai)有(you)一(yi)定(ding)的(de)二(er)聚(ju)性(xing)質(zhi)，可(ke)能(neng)會(hui)影(ying)響(xiang)目(mu)標(biao)蛋(dan)白(bai)的(de)定(ding)位(wei)，在(zai)使(shi)用(yong)該(gai)熒(ying)光(guang)蛋(dan)白(bai)時(shi)要(yao)綜(zong)合(he)考(kao)慮(lv)單(dan)體(ti)性(xing)質(zhi)和(he) PK 值。
在選擇熒光蛋白時，要考慮目標蛋白定位環境的 pH 值，再考慮使用相應 PK 值的熒光蛋白。同時也可以考慮利用熒光蛋白的 PK 值的特性，幫助我們解決問題。
成熟時間熒光蛋白在發光之前需要經曆轉錄、翻譯、zhediedengbuzhou，qizhongzhedieguochengzhanjuledabufenshijian，womenjiangciguochengchengzhiweichengshushijian。zaibiaojiduanshoumingdemubiaodanbaishi，ruguoyingguangdanbaidechengshushijiantaichang，kenenghuichuxianzaimubiaodanbaikaishijiangjieshi，yingguangdanbaihaimeiyoufaguang，daozhiwufazhuizongjidingweimubiaodanbai。yincizaixuanzeyingguangdanbaishi，xuyaokaolvqichengshushijian。
小編在實驗時發現，mEmerald、Dendra2 的成熟時間比較快，在用 Lipo2000 轉染試劑盒轉染 U2OS 細胞時，轉染後四個小時就能夠用熒光顯微鏡觀察到了熒光信號，EGFP 沒有信號。但是在用 P450 方法檢測時，Dendra2 會形成很大的聚集，表明該熒光蛋白的單體性質不好，有可能影響目標蛋白的定位和功能，在使用該蛋白的過程中應該注意這個特性。
為了能夠更早地觀察某些短壽命熒光蛋白的生理特性和定位情況，科學家正在發展成熟時間更快的熒光蛋白，並且用於超分辨成像。
guangwendingxingyingguangdanbaizaifaguangdetongshihuibeipiaobai，zhujianshiqufaguangnengli，yinciyaoxianghuodegengduodexinxi，jiuxuyaoyingguangdeguangwendingxinghao。zaiputongdeyingguangchengxiangzhong，duiyingguangdanbaideguangwendingxingyaoqiubingbushihengao，birujiguanggongjujiaoxianweijingchengxiangshi，yingguangxinhaodewendingxingzhixuyaonengbaozhengcaijidewanzhengdeyizhangtujike。
zaichaofenbianyingguangchengxiangzhong，duiyingguangdanbaideguangwendingxingyaoqiubijiaogao。xianxingjiegouguangzhaomingxianweijingyaoqiuyingguangdanbaishizhongchuyuliangdezhuangtai，xuyaotongguojiegouguangcaijiduofutujinxingzhonggou；非線性結構光顯微鏡則要求熒光蛋白在黑亮之間進行多次切換，這就要求熒光蛋白能進行反複的光調控，並且依舊維持著高的亮度；與非線性結構光顯微鏡一樣，可逆飽和光線性熒光轉移顯微鏡也要求熒光蛋白能夠在黑亮之間進行反複的光調控。
優you化hua密mi碼ma子zi大da多duo數shu熒ying光guang蛋dan白bai是shi來lai自zi於yu海hai洋yang生sheng物wu，因yin此ci密mi碼ma子zi偏pian好hao性xing與yu所suo要yao標biao記ji蛋dan白bai的de物wu種zhong有you較jiao大da的de差cha異yi，這zhe種zhong密mi碼ma子zi偏pian好hao性xing差cha異yi可ke能neng會hui導dao致zhi熒ying光guang蛋dan白bai在zai哺bu乳ru動dong物wu細xi胞bao或huo組zu織zhi中zhong的de表biao達da量liang極ji低di，以yi至zhi於yu看kan不bu到dao熒ying光guang信xin號hao。
幸xing運yun的de是shi大da多duo數shu熒ying光guang蛋dan白bai的de密mi碼ma子zi已yi經jing經jing過guo優you化hua，適shi合he在zai哺bu乳ru動dong物wu細xi胞bao中zhong進jin行xing融rong合he表biao達da。但dan是shi當dang需xu要yao使shi用yong熒ying光guang蛋dan白bai在zai其qi他ta種zhong屬shu細xi胞bao內nei表biao達da時shi，應ying考kao慮lv一yi下xia密mi碼ma子zi偏pian好hao性xing。
xiaobianzaijinxingxianchongyingguangchengxiangshi，jiuyudaoguocileiwenti，meiyouyouhuamimazishi，yingguangdanbaidebiaodaliangbijiaoruo，zaiyingguangdanbaijingguomimamimaziyouhua，bingqiezai DNA 序列之間插入線蟲的內含子後，熒光蛋白的表達量得到了較大的提高。
在比較少見的物種進行熒光成像時，需要把密碼子優化這個特性考慮在內。
N 端或 C 端在選擇了相應的熒光蛋白後，我們需要確定把目標蛋白放在熒光蛋白的 N 端或是 C 端。N 端與 C 端的區別在於目的蛋白，有的目的蛋白對這個要求不高，但某些目的蛋白就要求在特定的位置進行融合表達。
熒ying光guang蛋dan白bai與yu目mu的de蛋dan白bai融rong合he表biao達da可ke能neng會hui影ying響xiang目mu的de蛋dan白bai的de折zhe疊die，這zhe取qu決jue於yu目mu的de蛋dan白bai折zhe疊die過guo程cheng中zhong，熒ying光guang蛋dan白bai所suo在zai的de那na一yi端duan有you沒mei有you參can與yu蛋dan白bai質zhi的de折zhe疊die。
例如，如果目的蛋白的 C 端會被折疊入目的蛋白的內側，那麼我們把熒光蛋白標記在目的蛋白的 C 端，將獲得不到熒光信號；有些目的蛋白在後翻譯的過程會切掉一段，如果熒光蛋白處於被切的一端，那麼就不能獲得準確的目的蛋白的定位信息。
如果標記的目的蛋白是一個新的蛋白，我們建議分別進行 N 端和 C 端融合表達，以此來確定哪一個是zui好的選擇。除此之外，還可以用免疫熒光來確認目的蛋白定位是否與熒光蛋白融合表達的一致。
zongheyishangdejieshao，zaiwomenxuanzeyingguangdanbaishi，shouyaokaolvdeshiyingguangdanbaidejuhexingzhi，jishifouhuiyingxiangmudedanbaidegongnengjidingwei，qicishiyingguangdanbaide PK 值是否與目的蛋白所處的環境的 pH 值相匹配，然後是熒光蛋白的成熟時間以及目的蛋白的壽命，綜合兩者決定熒光蛋白是否合適，zui後考慮熒光蛋白的光穩定性、密碼子偏好性是否合適，zui後考慮目的蛋白放的位置，熒光蛋白是否會影響目的蛋白的功能及定位。
此ci外wai，在zai進jin行xing熒ying光guang成cheng像xiang時shi，需xu要yao考kao慮lv顯xian微wei鏡jing所suo選xuan的de濾lv光guang片pian是shi否fou與yu相xiang應ying的de熒ying光guang蛋dan白bai質zhi配pei套tao，顯xian微wei鏡jing的de各ge種zhong參can數shu是shi否fou合he適shi。值zhi得de提ti醒xing的de是shi，激ji發fa光guang的de強qiang度du不bu能neng太tai高gao，否fou則ze會hui導dao致zhi熒ying光guang信xin號hao的de漂piao白bai。
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