薄層色譜法實驗操作方法

薄層色譜法實驗流程

薄bo層ceng色se譜pu法fa係xi將jiang供gong試shi品pin溶rong液ye點dian於yu薄bo層ceng板ban上shang
，在zai展zhan開kai容rong器qi內nei用yong展zhan開kai劑ji展zhan開kai，使shi供gong試shi品pin所suo含han成cheng分fen分fen離li，所suo得de色se譜pu圖tu與yu適shi宜yi的de標biao準zhun物wu質zhi按an同tong法fa所suo得de的de色se譜pu圖tu對dui比bi，亦yi可ke用yong薄bo層ceng色se譜pu掃sao描miao儀yi進jin行xing掃sao描miao，用yong於yu鑒jian別bie
、檢查或含量測定。

1.儀器與材料

（1）薄層板  按支持物的材質分為玻璃板、塑料板或鋁板等
；按固定相種類分為矽膠薄層板、鍵合矽膠板、微晶纖維素薄層板、聚酰胺薄層板、氧化鋁薄層板等。固定相中可加入黏合劑
、熒光劑。矽膠薄層板常用的有矽膠 G
、矽膠 GF254、矽膠 H

、矽膠 HF254，G、H 表示含或不含石膏黏合劑
，F254 為在紫外光 254nm 波長到紫外線燈下顯綠色背景的熒光劑。按固定相粒徑大小分為普通薄層板（10~40µm）和高效薄層板（5~10µm）。

　　zaibaozhengsepuzhiliangdeqiantixia

，keduibocengbanjinxingtebiechulihehuaxuegaixingyishiyingfenlideyaoqiu
，keyongshiyanshizizhidebocengban。gudingxiangkelidaxiaoyibanyaoqiulijingwei 10~40μm。玻板應光滑、平整，洗淨後不附水珠。

　　（2）點樣器  一般釆用微升毛細管或手動、半自動、全自動點樣器材。

　　（3）展開容器  上行展開一般可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽展開缸，展開時須能密閉。水平展開用專用的水平展開槽。

　　（4）顯色裝置  噴霧顯色應使用玻璃噴霧瓶或專用噴霧器，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細霧狀噴出
；浸漬顯色可用專用玻璃器械或用適宜的展開缸代用
；蒸氣熏蒸顯色可用雙槽展開缸或適宜大小的幹燥器代替。

　　（5）檢視裝置  為裝有可見光、254nm 及 365nm 紫外光光源及相應的濾光片的紫外觀察箱
，可附加攝像設備供拍攝圖像用。紫外觀察箱暗箱內光源應有足夠的光照度。

　　（6）薄層色譜掃描儀  係xi指zhi用yong一yi定ding波bo長chang的de光guang對dui薄bo層ceng板ban上shang有you吸xi收shou的de斑ban點dian，或huo經jing激ji發fa後hou能neng發fa射she出chu熒ying光guang的de斑ban點dian
，進jin行xing掃sao描miao，將jiang掃sao描miao得de到dao的de譜pu圖tu和he積ji分fen數shu據ju用yong於yu物wu質zhi定ding性xing或huo定ding量liang的de分fen析xi儀yi器qi。

用於薄層色譜的紫外觀察箱、薄層分析用紫外線燈箱

薄層色譜法操作方法

　　（1）薄層板製備

　　市售薄層板  臨用前一般應在 110℃ 活化 30 分鍾。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板、塑su料liao薄bo層ceng板ban可ke根gen據ju需xu要yao剪jian裁cai，但dan須xu注zhu意yi剪jian裁cai後hou的de薄bo層ceng板ban底di邊bian的de固gu定ding相xiang層ceng不bu得de有you破po損sun。如ru在zai存cun放fang期qi間jian被bei空kong氣qi中zhong雜za質zhi汙wu染ran

，使shi用yong前qian可ke用yong三san氯lv甲jia烷wan、甲醇或二者的混合溶劑在展開缸中上行展開預洗，晾幹，110℃ 活化
，置幹燥器中備用。

　　自製薄層板  除另有規定外，將 1 份固定相和 3 份水（或加有黏合劑的水溶液
，如 0.2%~0.5%羥甲基纖維素鈉水溶液，或為規定濃度的改性劑溶液）在研缽中按同一方向研磨混合，去除表麵的氣泡後，倒入塗布器中，在玻板上平穩地移動塗布器進行塗布（厚度為 0.2~0.3mm），取下塗好薄層的玻板
，置水平台上於室溫下晾幹後，在 110℃ 烘 30 分鍾，隨即置於有幹燥劑的幹燥箱中備用。使用前檢查其均勻度，在反射光及透視光下檢視，表麵應均勻、平整、光滑
，並且無麻點
、無氣泡
、無破損及汙染。

　　（2）點樣  除另有規定外，在潔淨幹燥的環境中，用專用毛細管或配合相應的半自動
、自動點樣器械點樣於薄層板上。一般為圓點狀或窄細的條帶狀，點樣基線距底邊 10~15mm，高效板一般基線離底邊 8~10mm。圓點狀直徑一般不大於 4mm
，高效板一般不大於 2mm。接觸點樣時注意勿損傷薄層表麵。條帶狀寬度一般為 5~10mm，高效板條帶寬度一般為 4~8mm，可用專用半自動或自動點樣器械噴霧法點樣。點間距離可視斑點擴散情況以相鄰斑點互不幹擾為宜，一般不少於 8mm，高效板供試品間隔不少於 5mm。

　　（3）展開  將點好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑的深度為距原點 5mm 為宜，密閉。除另有規定外

，一般上行展開 8~15cm，高效薄層板上行展開 5~8cm。溶劑前沿達到規定的展距，取出薄層板，晾幹
，待檢測。

　　展開前如需要溶劑蒸氣預平衡，可在展開缸中加入適量的展開劑，密閉，一般保持 15~30 分(fen)鍾(zhong)。溶(rong)劑(ji)蒸(zheng)氣(qi)預(yu)平(ping)衡(heng)後(hou)，應(ying)迅(xun)速(su)放(fang)入(ru)載(zai)有(you)供(gong)試(shi)品(pin)的(de)薄(bo)層(ceng)板(ban)，立(li)即(ji)密(mi)閉(bi)，展(zhan)開(kai)。如(ru)需(xu)使(shi)展(zhan)開(kai)缸(gang)達(da)到(dao)溶(rong)劑(ji)蒸(zheng)氣(qi)飽(bao)和(he)的(de)狀(zhuang)態(tai)，則(ze)須(xu)在(zai)展(zhan)開(kai)缸(gang)的(de)內(nei)壁(bi)貼(tie)與(yu)展(zhan)開(kai)缸(gang)高(gao)、寬同樣大小的濾紙，一端浸入展開劑中
，密閉一定時間，使溶劑蒸氣達到飽和再如法展開。

　　必要時，可進行二次展開或雙向展開
，進行第二次展開前，應使薄層板殘留的展開劑完全揮幹。

　　（4）顯色與檢視  有(you)顏(yan)色(se)的(de)物(wu)質(zhi)可(ke)在(zai)可(ke)見(jian)光(guang)下(xia)直(zhi)接(jie)檢(jian)視(shi)，無(wu)色(se)物(wu)質(zhi)可(ke)用(yong)噴(pen)霧(wu)法(fa)或(huo)浸(jin)漬(zi)法(fa)以(yi)適(shi)宜(yi)的(de)顯(xian)色(se)劑(ji)顯(xian)色(se)，或(huo)加(jia)熱(re)顯(xian)色(se)

，在(zai)可(ke)見(jian)光(guang)下(xia)檢(jian)視(shi)。有(you)熒(ying)光(guang)的(de)物(wu)質(zhi)或(huo)顯(xian)色(se)後(hou)可(ke)激(ji)發(fa)產(chan)生(sheng)熒(ying)光(guang)的(de)物(wu)質(zhi)可(ke)在(zai)紫(zi)外(wai)線(xian)燈(deng)（365nm 或 254nm）下觀察熒光斑點。對於在紫外光下有吸收的成分，可用帶有熒光劑的薄層板（如矽膠 GF254 板），在紫外光燈（254nm）下觀察熒光板麵上的熒光物質淬滅形成的斑點。

　　（5）記錄  薄bo層ceng色se譜pu圖tu像xiang一yi般ban可ke采cai用yong攝she像xiang設she備bei拍pai攝she，以yi光guang學xue照zhao片pian或huo電dian子zi圖tu像xiang的de形xing式shi保bao存cun。也ye可ke用yong薄bo層ceng色se譜pu掃sao描miao儀yi掃sao描miao或huo其qi他ta適shi宜yi的de方fang式shi記ji錄lu相xiang應ying的de色se譜pu圖tu。

　　3.係統適用性試驗

　　按各品種項下要求對實驗條件進行係統適用性試驗，即用供試品和標準物質對實驗條件進行試驗和調整
，應符合規定的要求。

　　（1）比移值（Rf）  係指從基線至展開斑點中心的距離與從基線至展開劑前沿的距離的比值。

　　除另有規定外，雜質檢查時，各雜質斑點的比移值 Rf 以在 0.2~0.8 之間為宜。

　　（2）檢出限  係(xi)指(zhi)限(xian)量(liang)檢(jian)查(zha)或(huo)雜(za)質(zhi)檢(jian)查(zha)時(shi)，供(gong)試(shi)品(pin)溶(rong)液(ye)中(zhong)被(bei)測(ce)物(wu)質(zhi)能(neng)被(bei)檢(jian)出(chu)的(de)低(di)濃(nong)度(du)或(huo)量(liang)。一(yi)般(ban)采(cai)用(yong)已(yi)知(zhi)濃(nong)度(du)的(de)供(gong)試(shi)品(pin)溶(rong)液(ye)或(huo)對(dui)照(zhao)標(biao)準(zhun)溶(rong)液(ye)，與(yu)稀(xi)釋(shi)若(ruo)幹(gan)倍(bei)的(de)自(zi)身(shen)對(dui)照(zhao)標(biao)準(zhun)溶(rong)液(ye)在(zai)規(gui)定(ding)的(de)色(se)譜(pu)條(tiao)件(jian)下(xia)，在(zai)同(tong)一(yi)薄(bo)層(ceng)板(ban)上(shang)點(dian)樣(yang)
、展開、檢視
，後者顯清晰可辨斑點的濃度或量作為檢出限。

　　（3）分離度（或稱分離效能）  jianbieshi，gongshipinyubiaozhunwuzhisepuzhongdebandianjunyingqingxifenli。dangbocengsepusaomiaofayongyuxianliangjianzhahehanliangcedingshi，yaoqiudingliangfengyuxianglinfengzhijianyoujiaohaodefenlidu，fenlidu(R)的計算公式為：

　　R=2(d2-d1)/(W1+W2)

　　式中 d2 為相鄰兩峰中後一峰與原點的距離
；

　　d1 為相鄰兩峰中前一峰與原點的距離；

　　W1 及 W2 為相鄰兩峰各自的峰寬。

　　除另有規定外
，分離度應大於 1.0。

　　在zai化hua學xue藥yao品pin雜za質zhi檢jian查zha的de方fang法fa選xuan擇ze時shi，可ke將jiang雜za質zhi對dui照zhao品pin用yong供gong試shi品pin自zi身shen稀xi釋shi的de對dui照zhao溶rong液ye溶rong解jie製zhi成cheng混hun合he對dui照zhao溶rong液ye
，也ye可ke將jiang雜za質zhi對dui照zhao品pin用yong待dai測ce組zu分fen的de對dui照zhao品pin溶rong液ye溶rong解jie製zhi成cheng混hun合he對dui照zhao標biao準zhun溶rong液ye，還hai可ke釆釆用yong供gong試shi品pin以yi適shi當dang的de降jiang解jie方fang法fa獲huo得de的de溶rong液ye


，上shang述shu溶rong液ye點dian樣yang展zhan開kai後hou的de色se譜pu圖tu中zhong
，應ying顯xian示shi清qing晰xi分fen離li的de斑ban點dian。

　　（4）相對標準偏差  薄層掃描含量測定時，同一供試品溶液在同一薄層板上平行點樣的待測成分的峰麵積測量值的相對標準偏差應不大於 5.0%；需顯色後測定的或者異板的相對標準偏差應不大於 10.0%。

　　4.測定法

　　（1）鑒別  按各品種項下規定的方法，製備供試品溶液和對照標準溶液，在同一薄層板上點樣、展開與檢視，供試品色譜圖中所顯斑點的位置和顏色（或熒光）應與標準物質色譜圖的斑點一致。必要時化學藥品可采用供試品溶液與標準溶液混合點樣、展開，與標準物質相應斑點應為單一
、緊密斑點。

　　（2）限量檢查與雜質檢查  按各品種項下規定的方法，製備供試品溶液和對照標準溶液，並按規定的色譜條件點樣、展開和檢視。供試品溶液色譜圖中待檢查的斑點與相應的標準物質斑點比較，顏色（或熒光）不得更深
；或huo照zhao薄bo層ceng色se譜pu掃sao描miao法fa操cao作zuo，測ce定ding峰feng麵mian積ji值zhi，供gong試shi品pin色se譜pu圖tu中zhong相xiang應ying斑ban點dian的de峰feng麵mian積ji值zhi不bu得de大da於yu標biao準zhun物wu質zhi的de峰feng麵mian積ji值zhi。含han量liang限xian度du檢jian查zha應ying按an規gui定ding測ce定ding限xian量liang。

　　化學藥品雜質檢查可釆用雜質對照法、供gong試shi品pin溶rong液ye的de自zi身shen稀xi釋shi對dui照zhao法fa或huo兩liang法fa並bing用yong。供gong試shi品pin溶rong液ye除chu主zhu斑ban點dian外wai的de其qi他ta斑ban點dian與yu相xiang應ying的de雜za質zhi對dui照zhao標biao準zhun溶rong液ye或huo係xi列lie濃nong度du雜za質zhi對dui照zhao標biao準zhun溶rong液ye的de相xiang應ying主zhu斑ban點dian比bi較jiao，不bu得de更geng深shen，或huo與yu供gong試shi品pin溶rong液ye自zi身shen稀xi釋shi對dui照zhao溶rong液ye或huo係xi列lie濃nong度du自zi身shen稀xi釋shi對dui照zhao溶rong液ye的de相xiang應ying主zhu斑ban點dian比bi較jiao
，不bu得de更geng深shen。通tong常chang應ying規gui定ding雜za質zhi的de斑ban點dian數shu和he單dan一yi雜za質zhi量liang
，當dang釆釆用yong係xi列lie自zi身shen稀xi釋shi對dui照zhao溶rong液ye時shi
，也ye可ke規gui定ding估gu計ji的de雜za質zhi總zong量liang。

　　（3）含量測定  照薄層色譜掃描法，按各品種項下規定的方法，製備供試品溶液和對照標準溶液
，並按規定的色譜條件點樣、展開
、掃描測定。或將待測色譜斑點刮下經洗脫後
，再用適宜的方法測定。

5.薄層色譜掃描法

　　係(xi)指(zhi)用(yong)一(yi)定(ding)波(bo)長(chang)的(de)光(guang)照(zhao)射(she)在(zai)薄(bo)層(ceng)板(ban)上(shang)

，對(dui)薄(bo)層(ceng)色(se)譜(pu)中(zhong)可(ke)吸(xi)收(shou)紫(zi)外(wai)光(guang)或(huo)可(ke)見(jian)光(guang)的(de)斑(ban)點(dian)，或(huo)經(jing)激(ji)發(fa)後(hou)能(neng)發(fa)射(she)出(chu)熒(ying)光(guang)的(de)斑(ban)點(dian)進(jin)行(xing)掃(sao)描(miao)，將(jiang)掃(sao)描(miao)得(de)到(dao)的(de)圖(tu)譜(pu)及(ji)積(ji)分(fen)數(shu)據(ju)用(yong)於(yu)鑒(jian)別(bie)、jianzhahuohanliangceding。kegenjubutongbocengsepusaomiaoyidejiegoutedian，anzhaoguidingfangshisaomiaoceding，yibanxuanzefanshefangshi
，caiyongxishoufahuoyingguangfa。chulingyouguidingwai，hanliangcedingyingshiyongshishoubocengban。

　　掃(sao)描(miao)方(fang)法(fa)可(ke)采(cai)用(yong)單(dan)波(bo)長(chang)掃(sao)描(miao)或(huo)雙(shuang)波(bo)長(chang)掃(sao)描(miao)。如(ru)采(cai)用(yong)雙(shuang)波(bo)長(chang)掃(sao)描(miao)，應(ying)選(xuan)用(yong)待(dai)測(ce)斑(ban)點(dian)無(wu)吸(xi)收(shou)或(huo)小(xiao)吸(xi)收(shou)的(de)波(bo)長(chang)為(wei)參(can)比(bi)波(bo)長(chang)，供(gong)試(shi)品(pin)色(se)譜(pu)圖(tu)中(zhong)待(dai)測(ce)斑(ban)點(dian)的(de)比(bi)移(yi)值(zhi)（Rf 值）、guangpusaomiaodedaodexishouguangputuhuocededeguangpudaxishouhexiaoxishouyingyuduizhaobiaozhunrongyexiangfu，yibaozhengcedingjieguodezhunquexing。bocengsepusaomiaodingliangcedingyingbaozhenggongshipinbandiandeliangzaixianxingfanweinei，biyaoshikeshidangtiaozhenggongshipinrongyededianyangliang，gongshipinyubiaozhunwuzhitongbandianyang、展開、掃描
、測定和計算。

　　bocengsepusaomiaoyongyuhanliangcedingshi
，tongchangcaiyongxianxinghuiguierdianfajisuan，ruxianxingfanweihenzhaishi，keyongduodianfaxiaozhengduoxiangshihuiguijisuan。gongshipinrongyeheduizhaobiaozhunrongyeyingjiaochadianyutongyibocengbanshang，gongshipindianyangbudeshaoyu 2 個，標準物質每一濃度不得少於 2 個。掃描時，應沿展開方向掃描

，不可橫向掃描。

上圖：用於薄層色譜的雙波長紫外線燈LEAC-280L