紫外線交聯和免疫沉澱（CLIP）

作者：上海峰誌時間：2026-04-09 05:12:06瀏覽10317 次

信息摘要：

CLIP已被開發為使用UV測定RNA-蛋白質複合物體內交聯的常用方法。裂解交聯細胞後，通過免疫沉澱（IP）分離靶蛋白。為了對逆轉錄的特異性引物進行測序，RNA接頭被轉移到3'末端，放射性標記的磷酸鹽被連接到5'末端。使用凝膠電泳和膜轉移從遊離RNA中分離RNA-蛋白質複合物。然後進行蛋白酶K消化以從複合物中去除蛋白質。

紫外線交聯和免疫沉澱（CLIP）

原則

紫外線（UV）交聯是RNA生物化學家用來研究活組織中RNA-蛋白質複合物的經典體外工具。科學家們已經成功地使用CLIP（RNA-蛋白質複合物的交聯和免疫沉澱）來鑒定神經元特異性RNA結合蛋白Nova家族的許多靶RNA。隨著CLIP技術的發展，科學家們正在試行將其與其他幾種感興趣的RNA結合蛋白一起使用，特別是FMRP和Hu家族。

圖1.CLIP的基本原理。暴露於紫外線時，近端蛋白質和RNA之間形成共價鍵。這些鍵隻發生在直接接觸的部位，並保留RNA-蛋白質相互作用。

紫外線（UV）暴露後，相鄰蛋白質和核酸之間形成共價鍵。基於這一特殊原理，CLIP已被開發為使用UV測定RNA-蛋白質複合物體內交聯的常用方法。裂解交聯細胞後，通過免疫沉澱（IP）分離靶蛋白。為了對逆轉錄的特異性引物進行測序，RNA接頭被轉移到3'末端，放射性標記的磷酸鹽被連接到5'末端。使用凝膠電泳和膜轉移從遊離RNA中分離RNA-蛋白質複合物。然後進行蛋白酶K消化以從複合物中去除蛋白質。此步驟在交聯位點留下肽，從而鑒定交聯核苷酸。將RNA接頭連接到5'末端後，通過RT-PCR合成cDNA。後一個cDNA核苷酸通過高通量測序鑒定。將讀段映射回轉錄組可以識別相互作用位點。

程序

圖2.CLIP測定的工作流程。

1. 組織的紫外線交聯

從小鼠身上收獲大腦、脊髓或其他靶組織。將組織放在冰冷的HBSS中，直到收獲完成。設置一個500mL的Stericup，取下纖維素過濾器，然後用200μm尼龍網片製作一個錐形過濾器以替換它。所得細胞懸液約為100mL，用於10個大腦。接下來，將組織懸液轉移到 50mL 管中，並在 4°C 下以 2500g 離心 5 分鍾。除去上清液並將組織重懸於原始組織體積的約10倍。將懸浮液放入150mm組織培養皿中，並將懸浮液放入紫外交聯儀照射400mJ / cm2。交聯時，在組織懸浮液下方使用一盤冰塊以保持懸浮液低溫。

將輻照的懸浮液收集在50mL管中，然後用額外的5mL HBSS洗滌每個板，也收集這種洗滌。在4°C下以2500rpm再次旋轉組織5分鍾。將組織重懸於原始組織體積的2倍，並將溶液移液到管中。短暫旋轉試管並取出上清液。在-80°C下冷凍直至使用。

2. 珠子製備

移液 100μL 蛋白 A Dynabead 珠溶液。將磁珠放入磁性支架中，用 500μL 1X PXL 捕獲和清洗磁珠。再重複洗滌兩次。將磁珠重懸於 100μL 的 1X PXL 中，並加入適量的抗 RNA 結合蛋白抗體。在室溫下搖動試管30分鍾至45分鍾，使抗體與磁珠結合。用 1X PXL 清洗珠子三次。

3. 交聯裂解液檢查

使用 100μL 冰冷的 1X PXL 裂解每 100μL 交聯細胞。將裂解物放在冰上10分鍾。向每個試管中加入 10μL RNasin 和 10μL RQ1 脫氧核糖核酸酶;在 37°C 下孵育 15 分鍾。向溶液中加入 1μL RNase T1 儲備液（1 U/μL）;在37°C孵育10分鍾，以1000rpm振蕩。接下來，在預冷的微量超速離心機中以 90K 在 4°C 下旋轉裂解物 25 分鍾。

4. 免疫沉澱

對於免疫沉澱，小心地從沉澱碎片中除去上清液，並將上清液添加到一管製備的珠子中。每 300μL 交聯組織使用約 100μL 磁珠。在 4°C 下搖動珠子/裂解物 1 小時。用 1mL 冰冷的 1X PXL 清洗 3 次，用 1mL 冰冷的 1X PNK+ 清洗兩次。

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5. 激酶免疫沉澱的RNA

將磁珠重懸於80μL 1X PNK+中，加入5μL P32 γ-ATP（γ-腺苷三磷酸）（>3000Ci/mM）和2μL PNK酶。在37°C的熱混合器中孵育，並以1000rpm離心20分鍾。通過加入5μL 1mM ATP完成反應。讓反應在 37°C 下再繼續 5 分鍾。用 1mL 冰冷的 1X PNK+ 清洗珠子四次。將磁珠重懸於30μL 1X PNK+和30μL Novex LDS上樣緩衝液中。

6. SDS-PAGE凝膠和轉印

加載 2 孔/管的 Novex NuPAGE 10% 雙三凝膠。在150V下運行凝膠，直到染料前沿位於凝膠底部。凝膠電泳後，使用Novex濕轉印裝置將凝膠轉移到一塊S&S BA-85硝酸纖維素上。轉移後，用1X PBS衝洗NC過濾器，並在餐巾紙上輕輕吸幹。用保鮮膜包裹膜並暴露在薄膜下。

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7. 切出交聯的RNA-蛋白質複合物

一般來說，RNA-蛋白質複合物以大約蛋白質和RNA的總分子量運行。使用手術刀刀片切掉這條帶子，然後將硝酸纖維素切成小塊。將這些碎片放入一個幹淨的管子中。

8. RNA分離純化

在1X PK緩衝液中製備4mg / mL蛋白酶K溶液;將該儲備液在 37°C 下預孵育 20 分鍾以消化任何 RNase。向每管分離的NC片中加入200μL該蛋白酶K溶液;在37°C振蕩（1200rpm）孵育20分鍾。加入 200μL PK/7 M 尿素緩衝液;在37°C振蕩（1200rpm）下再孵育20分鍾。

加入 400μL RNA 苯酚和 130μL CHCl3 溶液。渦旋這些管，然後在37°C下以1400rpm振蕩（1200rpm）孵育20分鍾。接下來，在4°C或室溫的微量離心機中全速旋轉管10分鍾。將每個試管的水相放入幹淨的試管中，加入 50μL 3M NaOAc、pH 5.2 和 1mL 的 1：1 乙醇和異丙醇混合物。在 −20°C 下沉澱過夜。

9. 核糖核酸連接

在冷離心機中全速旋轉RNA30分鍾。用 100μL 75% 乙醇洗滌沉澱，然後在 SpeedVac 中幹燥沉澱。通過切倫科夫計數在閃爍計數器中計數RNA。使用 T4 RNA 連接酶進行 RNA 連接。

10. 連接RNA的純化

如上所述旋轉、洗滌和幹燥 RNA 沉澱。通過閃爍計數器中的Cerenkov計數檢查RNA回收率。倒入20%變性聚丙烯酰胺凝膠（1：19雙：丙烯酰胺，7M尿素）。將整個連接反應重懸於5μL H 2 O和5μL甲酰胺上樣緩衝液中。將重懸的RNA在95°C下加熱5分鍾，然後將整個溶液上樣到凝膠上;使用放射性標記的PhiX標記物來調整RNA的大小。

凝膠電泳後，將凝膠放在一塊舊薄膜上，並用保鮮膜包裹。將薄膜放在-80°C下，通常過夜以獲得良好的信號。使用曝光的薄膜，切出大於約65nt的RNA。將凝膠切片放入試管中;加入350μL核酸洗脫緩衝液，用1mL注射器柱塞壓碎;在熱混合器中以 37°C 以 1200rpm 孵育 30 分鍾。用切斷的P1000，將凝膠漿液轉移到已添加1cm玻璃預過濾器的色譜柱中。在微量離心機中全速旋轉色譜柱，取出流通物並將其放入幹淨的管中。加入 1mL 1：1 乙醇和異丙醇混合物以及 2μL 糖原（20mg/mL 原液），並在 −20°C 下沉澱過夜。

11. cDNA 和 PCR

如上所述旋轉、洗滌和幹燥 RNA;在閃爍計數器中再次計數RNA以定量產量。將純化的RNA重懸於9μL H 2 O中，並以5pmol/μL加入2μL DP3。在65°C加熱5分鍾;放鬆和快速旋轉。將RNA逆轉錄成cDNA，並進行PCR擴增。

倒入10%變性聚丙烯酰胺凝膠，並在凝膠上運行約10μL的PCR反應;使用放射性標記的標記物和放射自顯影凝膠。剪掉大約 60-100nt 的主要波段（如果有的話，還可以切掉 100nt 及以上）。像上麵對RNA所做的那樣純化和沉澱DNA，但讓DNA從粉碎的凝膠漿液中洗脫至少4小時。沉澱後，將純化的DNA重懸於5–10μL水中。

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12. TOPO克隆和測序

我們又使用了三到四輪PCR（如果您的次PCR產量較低，則可以使用更多）。使用離心柱對反應進行脫鹽。然後，生成 3' A 端。在72°C孵育20分鍾;放在冰上，立即用於TOPO克隆反應。輕輕混合並在室溫下孵育 5 分鍾（儲存 3μL，在 −20°C 下進行天克隆時不使用，以進行潛在的後續轉化）。按照 TOPO 克隆試劑盒的建議轉化大腸杆菌。像其他測序反應一樣對單個轉化體進行小型製備和測序。

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